辣椒(Capsicum spp.)是我国的主要果菜之一，据考证，我国现有栽培辣椒是明朝末年开始从国外引入，在分类上一般属于一年生辣椒(Capsicum annuum) (李曙轩, 1986)。C. annuum也是世界上栽培最广泛、类型最丰富的种(Pickersgill, 1997)，根据果实生长习性可以进一步分为长椒、圆锥椒、灯笼椒、簇生椒和樱桃椒等5个变种，但现代分子生物学技术研究表明，C. annuum遗传基础狭窄，种内遗传差异小(Paran, et al., 1998; Rodriguez, et al., 1999; 陈学军等, 2006)。因此，开展辣椒属种间遗传资源，特别是野生辣椒遗传资源利用研究，在DNA分子水平上明晰其遗传差异，对于拓展C. annuum遗传基础、改良C. annuum种质具有重要意义。

我国野生辣椒种质资源主要分布于云南西双版纳和海南等热带地区，当地俗称“小米椒”，在分类上属于灌木辣椒(C. frutescens) (中国科学院云南植物研究所, 1979; 庄灿然等, 1995)。我国野生灌木辣椒与一年生辣椒(C. annuum)及美洲灌木辣椒的亲缘关系一直是人们非常关注的问题，但长期以来，对这一重要野生种质资源的研究主要停留在形态描述和表型分析上(邓明华和文锦芬, 2009, 辣椒杂志, 1: 36-37; 陈学军等, 2009)，尚未见在DNA水平上对其遗传多样性进行评价研究的报道。SRAP分子标记(Sequence-related Amplified Polymorphism)是一种基于PCR的新型分子标记技术(Li and Quiros, 2002)，具有操作简便、快速，多态性丰富，重复性好以及不需预知物种序列信息等优点，是研究者首选的DNA标记技术之一。目前，该技术已在基因定位、遗传图谱构建和遗传多样性研究等诸多领域广泛应用(王建设等, 2007; 陈锋等, 2007; Ferriol, et al., 2003; 林忠旭等, 2004)。为此，作者在前期研究基础上(陈学军等, 2006; 2009)，应用SRAP分子标记技术，对41份辣椒属栽培种不同类型材料、野生灌木辣椒和种间杂交后代进行分析，旨在探明我国野生灌木辣椒与美洲灌木辣椒亲缘关系，以及与一年生辣椒(C. annuum)遗传差异，探讨人工选择条件下种间杂交后代亲缘关系的演化，为辣椒的分类、种间优异基因的利用及新材料创制提供理论参考。

1结果与分析
1.1 SRAP扩增结果
以B9431和H108基因组DNA进行SRAP引物组合的筛选，从198对引物组合中筛选出多态性丰富、扩增谱带清晰的引物组合20对。20对引物组合共在902个位点扩增出条带，扩增条带最多的引物组合是Me8-Em21，为70条；最少的是Me10-Em2和Me10-Em8，仅有28条；平均每个引物组合扩增位点45.1个。多态性位点385个，多态性比例为46.24%(图1)。扩增谱带大小在50~2 000 bp之间，且主要分布在100~700 bp范围。

图1 引物组合Me8/Em21的SRAP扩增结果 注: 1-41为种质代号; 箭头所指为野生灌木辣椒特异片段; M为DNA marker Figure 1 The SRAP amplified profile using the primers combination Me8/Em21 Note: 1-41 are the accession code listed in table 1; The arrow marked specific bands of wild C. frutescens; M is DNA marker

 
1.2遗传相似性分析
1.2.1种间及种内遗传相似系数
以902个位点的谱带数据为矩阵，41份辣椒材料共获得820个遗传相似系数，其范围在0.709~0.982之间，平均为0.889 (表1)。其中，种质15与种质16遗传相似系数最大，达到0.982，种质1与种质41、种质2与种质3遗传相似系数最小，均为0.709。
 

表1 辣椒遗传相似系数分析 Table 1 Analysis on the similarity correlation on SRAP in pepper

29份C. annuum材料遗传相似系数在0.923~0.982之间，平均0.944。3份C. frutescens种质遗传相似系数在0.885~0.920之间，平均为0.902，其中，种质2与种4遗传相似系数为0.920，分别大于种质2与种质5 (0.901)及种质4与种质5 (0.885)遗传相似系数。4个种种间遗传相似系数在0.738~0.770之间，平均为0.755。明显小于C. annuum及C. frutescens种内遗传相似系数。种质2、4和5与C. annuum平均相似系数依次为0.730、0.733和0.750，说明我国海南野生灌木辣椒种质(种质2, 4)与C. annuum亲缘关系要远于美洲灌木辣椒(种质5)与C. annuum亲缘关系。

1.2.2种间杂交后代遗传相似系数
种间杂种(种质1)与母本遗传相似系数为0.854，大于其与父本的遗传相似系数(0.786)。6份种间杂交后代遗传相似系数在0.878~0.932之间，平均为0.908。从表2看到，不同世代种间杂交后代与母本(C. annuum)的遗传相似系数，随世代增加而提高；至F4代，种间杂交后代与母本的遗传相似系数平均为0.950，已超过C. annuum种间遗传相似系数平均值。而与父本的遗传相似系数，不同世代间则无明显变化，处于较低水平。
 

表2 种间杂交后代与双亲间遗传相似系数 Table 2 The similarity correlation between progeny from interspecific hybridization and their parents

1.3野生灌木辣椒的特异扩增片段
野生灌木辣椒种质2和种质4在用引物组合Me8-Em21和Me9-Em17扩增时，分别产生1条特异扩增片段，它们是Me8-Em21/385 bp (图1)和Me9-Em17/50 bp。这2条特异片段都能将海南野生灌木辣椒种质与美洲灌木辣椒种质及其他材料有效区分开来，可作为海南野生灌木辣椒特征性指纹图谱，为其鉴定、保持和利用提供分子证据。

1.4聚类分析
利用SRAP多态性条带所得的遗传相似性矩阵，经过聚类分析构建供试材料的亲缘关系树状图(图2)。以相似系数0.831为阀值，41份材料分为4大类群，即C. annuum+种间杂交材料类群、C. frutescens类群、C. chinense类群和C. baccatum类群。在C. annuum +种间杂交材料类群中，包含所有的C. annuum材料和种间杂交材料；野生种质2、4与美洲种质5则构成C. frutescens类群，种质6和种质41分别聚为C. chinense类群和C. baccatum类群。

图2 41份辣椒材料SRAP聚类图 Figure 2 Cluster analysis of 41 accessions in pepper based on SRAP data

C. annuum +种间杂交材料类群在相似系数0.907处可分为4组，第Ⅰ组包含所有C. annuum材料和种间杂交后代AC3-2-1 (种质7)、AC4-7-3-1 (种质12)；第Ⅱ组为种间杂交材料AC3-6-8 (种质8)；第Ⅲ组由种质9、11和13组成，它们都是源于C. annuum×C. chinense种间杂交后代，第Ⅳ组为种间杂种B9431×H108。

第Ⅰ组在相似系数0.921处进一步分为2个亚组，第1亚组有种质3、10、15、16、17、18、19、20、21、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38和39，包含了C. annuum中的长椒、圆锥椒和簇生椒种质，如大果形牛角椒(种质15, 16, 19和21)、早熟羊角椒(种质3, 29, 31, 32和33)和线椒(种质17, 18和20)等种质都归于此类。第2亚组有种质7、12、14、22、23、24、25、26、27、30和40，包含了C. annuum中的灯笼椒、樱桃椒、圆锥椒、长椒和2个种间杂交材料，所有甜椒材料(种质14, 24, 25, 26和27)都归于此类。

2讨论
基于SRAP技术，本研究对41份不同类型辣椒材料进行了分析，扩增片段的多态性比例高达46.24%，材料间遗传相似系数变幅从0.709~0.982之间，平均为0.889；其中，C. annuum材料之间遗传相似系数在0.923~0.982之间，平均0.944，显著高于41份材料的变幅及总均值，说明辣椒属种间变异大于种内变异，C. annuum遗传基础狭窄，这与基于RAPD和AFLP技术的研究结果是一致的(Paran, et al., 1998; Rodriguez, et al. , 1999; 陈学军等, 2006)。

在供试的29份C. annuum材料中，一部分形态和生物学性状类似的种质首先聚在一起，如种质14、15和16均为大果、中熟牛角椒品种，种质24、25、26和27均为甜椒品种。但总的来看，基于SRAP标记的分子聚类与C. annuum形态分类并不对应，如第1小组和第2小组均有长椒和圆锥椒材料。其原因一方面可能是辣椒为常异交自花授粉作物，C. annuum不同亚种及不同品种之间容易因天然杂交而产生基因转移现象；另一方面，人工引种打破了地理隔离的界限，强大的人工选择压力，使品种间基因转移和交换过程加快，而一些稀有变异类型也可能在品种改良过程中丢失。

海南野生灌木辣椒植株高大、叶阔卵形，花冠绿白色，果实单生或双生，果顶直立向上，纺锤状，晚熟，味香辣，当地素有采食习惯。本研究结果显示：海南野生灌木辣椒具有美洲同类种质所没有的特异条带，它们之间的遗传相似系数平均为0.893，远低于C. annuum材料间的遗传相似系数，说明海南野生灌木辣椒与美洲灌木辣椒存在较大的遗传差异。此外，海南野生灌木辣椒与C. annuum遗传相似系数平均为0.732，要小于美洲灌木辣椒种质与C. annuum遗传相似系数(0.750)，表明海南野生灌木辣椒与C. annuum亲缘关系要稍远于美洲灌木辣椒与C. annuum亲缘关系。我国海南地区气候条件和生态环境与中南美洲类似，可能是因为地理隔离或起源地的不同，才导致海南野生灌木辣椒与美洲灌木辣椒有较大的SRAP扩增位点差异。

种间杂交是实现基因转移的重要途径，本研究对辣椒种间杂交材料进行了SRAP分析，结果显示，随着自交世代的增加，种间杂交材料与其母系亲本(C. annuum)遗传相似系数越来越大，至F4代，遗传相似系数已达0.943~0.956，达到C. annuum种内亲缘关系水平。而与父系亲本(C. chinense)相似系数则无显著变化，仍处于较低水平。这可能是因为人工选择多倾向于选择综合性状优良的单株进行自交留种，而C. annuum已长期人工驯化栽培，相比于其他栽培种或野生种，C. annuum具有更广的适应性和更佳的商品性，因此，人工选择结果使种间杂交后代迅速向C. annuum遗传背景转化。已有研究表明，C. chinense和C. frutescens具有抗多种病害的有利性状(Monma and Sakata, 1997; Bosland, 2000; Souza and Cafe Filho, 2003; Khaderk et al., 2007)，因此，通过种间杂交途径可以将C. chinense或C. frutescens抗病基因转移至C. annuum中，从而拓展C. annuum遗传基础，创新辣椒种质。

3材料与方法
3.1供试材料
选取有代表性的辣椒材料共41份(表3)，其中C. annuum 材料29 份，分属于长椒、圆锥椒、灯笼椒、簇生椒和樱桃椒等5个变种； C. frutescens 种质3份，含中国海南野生种质2份，美国种质1份；C. chinense和C. baccatum各1份；种间杂种C. annuum×C. frutescens (F₁) 1份，种间杂交后代C. annuum×C. chinense (F₂~F₄)6份。

表3 41份辣椒材料代号及来源 注：#引自美国国家种质资源实验室，其它材料来自江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 Table 3 The 41 pepper accessions codes and origin Note: # Introduced from National Germplasm Resources Laboratory, USA, and the other accessions provided by Vegetable and Flower Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences

2009年3月16日播种育苗，4月25日定植，每个材料定植20株。SRAP试验于2009年6~11月在江西省农科院油料作物重点实验室进行。

3.2 DNA提取
在辣椒生长盛期采摘植株嫩叶，采用改良CTAB法(Murry and Thompon, 1980)提取基因组DNA。用UV-1240型紫外分光光度计检测DNA溶液浓度与纯度，并将其稀释为50 ng/μl，-20℃保存备用。

3.3引物组合筛选与反应体系
以材料B9431和H108基因组DNA为模板，筛选SRAP引物组合。从198对引物组合中筛选出多态性好、扩增条带稳定的引物组合20对进行本试验分析。PCR反应体系参照本试验室优化的10 μL体系进行(周坤华等, 2010)，其中Taq酶0.75 U、Mg²⁺ 0.6 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.8 μmol/L、模板DNA 50 ng。PCR反应在Eppendorf公司的PCR仪中进行，扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，35℃1 min，72℃ 1 min，5个循环；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。

PCR产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶(7 mol/L)尿素电泳，电泳缓冲液为1×TBE，70w恒功率电泳1.5小时。银染法(许绍斌等, 2002)染色显影，在荧光灯上观察分析条带。

3.4数据统计分析
将电泳图谱上清晰的条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”， 获得数据矩阵。用Ntsys2.0软件计算遗传相似系数并进行聚类分析，遗传相似系数(genetic similarity, GS)以Jaccard系数表示，UPGMA方法聚类，得到亲缘关系树状图。
 
作者贡献
周坤华、方荣是本研究的实验设计和实验研究的执行人；周坤华完成数据分析，论文初稿的写作；方荣参与论文修改；陈学军是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(30860173)和(31060203)资助。

参考文献
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